脊髓GluN1在急性阿片药物诱导痛觉过敏中的作用及调节机制

【摘要】研究背景阿片类药物在治疗各种伤害性刺激（手术、创伤等急性疼痛，各种慢性疼痛）的同时会带来许多不良反应，如药物依赖，耐受，成瘾及阿片药物诱导痛觉过敏（Opioidinducedhyperalgesia,OIH）等。急性OIH被IASP定义为“基于阿片样物质的麻醉和手术后的疼痛感知增加”。瑞芬太尼是超短效的μ-阿片受体激动剂被广泛应用于全身麻醉中的镇痛,其产生痛觉过敏的发生率明显高于其他阿片类药物。研究表明中枢系统NMDA受体功能和数量的改变在瑞芬太尼痛觉过敏的形成过程中发挥了重要的作用,但目前针对脊髓背角神经元NMDA受体GluN1亚基功能改变和关键蛋白激酶在瑞芬太尼痛觉过敏机制的报道不多。本研究旨在从整体、亚细胞、分子等不同水平以非切口疼痛细胞模型研究瑞芬太尼对NMDA受体电生理变化的影响；瑞芬太尼、氯胺酮、纳洛酮对GluN1磷酸化激活的影响；蛋白激酶C（PKC）和钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶（CaMKII）对GluN1磷酸化的影响三个方面阐述由瑞芬太尼诱发的GluN1亚基活性改变，探讨GluN1磷酸化在OIH中的机制及作用，从而推断在初级传入感觉神经元谷氨酸受体调节和其在OIH发生和维持阶段的作用，以期为进一步研究阿片受体、NMDA受体在OIH乃至神经元退行性变以及急性疼痛慢性化演变的作用与机制，开发新的疼痛治疗药物奠定基础。蛋白磷酸化是离子型谷氨酸受体NMDA翻译后修饰的重要机制，GluN1亚基C末端具备多个丝/苏氨酸磷酸化位点，通过对这些不同的位点进行结构磷酸化和活性依赖的磷酸化引起细胞和突触输入可逆的变化。本研究拟以大鼠脊髓背角神经元痛觉过敏模型为基础,探讨影响GluN1磷酸化的各种因素，从而揭示μ受体—Ca2+—PKC和CaMKII—GluN1受体激活的信号转导途径机制，证明瑞芬太尼对脊髓背角神经细胞NMDA受体GluN1亚基功能和表达的影响以及PKC和CaMKII在急性OIH发生发展中的调节作用。第一部分急性瑞芬太尼暴露后脊髓NMDA受体电生理变化特点目的：探讨脊髓背角神经元细胞在急性瑞芬太尼暴露后N-甲基-D-天冬氨酸(GluN）的电流活动的浓度和时间变化特点，明确最大电流对应的药物浓度。方法：原代培养E18-19d的胚胎大鼠脊髓背角神经细胞，随机分为4组，对照组（C组）给予生理盐水，R1组（4nM）,R2组（6nM),R3组（8nM）瑞芬太尼作用原代大鼠脊髓背角神经元细胞60min后，采用全细胞膜片钳技术记录瑞芬太尼作用前（T0)、20min（T1)、40min（T2）、60min（T3）、80min（T4）、100min（T5）的电流。结果：与C组相比，R1组、R2组、R3组在各时间点最大电流振幅均显著升高，并呈显著的时间依赖性，4nM瑞芬太尼（R1组）与6nM（R2组）、8nM（R3组）最大电流振幅在T2、T3、T4显著增加（P<0.05）；呈现迅速而持久的变化趋势。结论：4nM瑞芬太尼对GluN的电流增幅相比6、8nM瑞芬太尼明显。瑞芬太尼导致大鼠背角神经元GluN的快速且持久的电活动增加可能是OIH的电生理基础，其对应的分子机制尚不明确，以4nM瑞芬太尼为研究对象进行以下研究。第二部分瑞芬太尼诱导的脊髓GluN1亚基磷酸化目的：研究大鼠脊髓背角神经元经急性瑞芬太尼暴露后GluN1亚基发生磷酸化及其时间依赖性；氯胺酮、纳洛酮对GluN1的磷酸化的影响。方法：原代培养大鼠脊髓背角神经元分为6组，A组：瑞芬太尼+甘氨酸组，B组：甘氨酸组；C组：瑞芬太尼+甘氨酸+氯胺酮组，D组：甘氨酸+氯胺酮组；E组：瑞芬太尼+甘氨酸+纳洛酮组，F组：甘氨酸+纳洛酮组。利用Westernblot实验检测洗脱后1h、2h、4h、24hGluN1的GluN1和磷酸化GluN1（p-GluN1）。逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）试验揭示瑞芬太尼、氯胺酮、纳洛酮对GluN1mRNA的影响。结果:WesternBlot实验发现GluN1A组四个时间点GluN1表达均明显少于B组（P<0.01），组内p-GluN1在4h和24h相比1h和2h明显增加（P<0.05）；A和B两组相比C、D组各自的GluN1数量减少更显著；EF两组在2、4、24hGluN1表达显著性差异。A组p-GluN1浓度则从1h开始缓慢增加在24h达到峰浓度；E组内p-GluN1在2h、4h、24h相比1h差异增加（P<0.05）。各组PCR的GluN1mRNA表达也呈现明显的时间依赖性，6组中加入瑞芬太尼后1、2、4、24hGluN1mRNA表达均明显减少（P<0.05），以4h和24h受抑制最明显；C、D两组则更明显，随时间延长对GluN1mRNA表达抑制一直持续至24h，且A、C两组相比随着氯胺酮的加入对GluN1mRNA表达抑制更加明显（P<0.05）；E、F两组除在2h对GluN1mRNA表达没有明显影响外，其余时间点仍显示对GluN1表达是抑制作用。结论:4nM瑞芬太尼使大鼠脊髓背角神经细胞膜上GluN1表达减少，GluN1磷酸化增加和抑制GluN1mRNA表达是其内向电流增加的分子基础，呈现时间依赖特点。μ受体在GluN1亚基激活中发挥了重要作用，磷酸化GluN1表达增加是OIH的相关分子机制之一。第三部分PKC及CaMKII对瑞芬太尼暴露后脊髓GluN1亚基磷酸化的影响目的：研究急性瑞芬太尼暴露对大鼠脊髓背角神经元PKC及CaMKII表达的影响以及PKC及CaMKII对脊髓NMDA受体GluN1亚基磷酸化的影响。方法：原代培养大鼠脊髓背角神经细胞，经4nm浓度瑞芬太尼60min后洗脱，立即和间隔1h测定PKC和CaMKII表达，并分别加入50和100μmo/L的KN93和Chelerythrine作用30min后，利用Westernblotting分别测定瑞芬太尼作用60min和120min后的GluN1和磷酸化GluN1（p-GluN1）表达。结果：4nm瑞芬太尼作用大鼠脊髓背角神经元1h后PKC浓度明显增加并持续至2h（P<0.05），CaMKII浓度1h变化不明显，2h开始增加。2hPKC浓度开始下降CaMKII浓度上升。GluN1变化时间表达逐渐减少，但无显著性差异；p-GluN1则随时间表达逐渐增强。A1组和A2组加入KN93后再测定p-GluN1，A1组显著降低（0.42vs0.21；P<0.05），A2组（0.49vs0.33；P<0.05），KN93拮抗CaMKII后GluN1的磷酸化明显受抑制。B1组和B2组加入chelerythrine作用1h后再测定p-GluN1，B1组显著降低（0.42vs0.26；P<0.05），B2组（0.49vs0.36；P<0.05），加入chelerythrine后GluN1的磷酸化明显受抑制。结论：PKC和CaMKII参与了GluN1的磷酸化，由PKC介导GluN磷酸化是急性OIH起始的因素，而由CaMKII介导的磷酸化是OIH维持的主要原因；选择性抑制PKC或CaMKII是治疗OIH的靶点。
【作者】郁葱；
【导师】邓锋；
【作者基本信息】重庆医科大学，组织工程与细胞工程，2014，博士
【关键词】阿片药物诱导痛觉过敏；蛋白激酶C；钙/钙调蛋白依赖蛋白激酶Ⅱ；GluN1；磷酸化；

【参考文献】
[1]何美.对北京市部分中老年人体育舞蹈编排特点的研究[D].北京体育大学,体育教育训练学,2013,硕士.
[2]记者桂运安.中英科学家石墨烯研究取得突破[N].安徽日报,2014-03-14005.
[3]王艳芹.德州市扫盲教育初探（1949-1957）[D].西北师范大学,中国近现代史,2013,硕士.
[4]刘正威.黄山世界文化与自然双遗产的可持续发展研究[D].中国地质大学（北京）,地理学,2013,硕士.
[5]付晓风.鲜绿茶叶中茶多酚的提取和纯化研究[D].南昌大学,化学工程（专业学位）,2012,硕士.
[6]胡明.创业板证券市场交易制度和保荐人制度研究[D].安徽大学,法律,2003,硕士.
[7]朱向华.软硬件协同设计之软硬件划分技术研究[D].山东师范大学,计算机应用技术,2013,硕士.
[8]马晶晶.吉林省体育社团现状与对策研究[D].东北师范大学,体育人文社会学,2012,硕士.
[9]肖旭斌.美国引进烤烟品种的农业与工业验证[D].湖南农业大学,作物学,2012,硕士.
[10]潘立宁.建国以来中国婚礼婚俗样式演变之社会根源研究[D].内蒙古科技大学,思想政治教育,2013,硕士.
[11]岳麓,潘郁.动态层次分析法在客户关系管理系统中的应用[J].南京工业大学学报(自然科学版),2004,05:81-86.
[12]胡亚杰.电动力学法去除污泥中重金属研究[D].河南科技大学,应用化学,2013,硕士.
[13]王曰芬,王倩,丁晟春.基于知识管理平台重构情报研究工作系统[J].情报资料工作,2004,03:5-8.
[14]朱衍镛.零井源距VSP初至旅行时反演[J].石油地球物理勘探,1991,06:711-719+799.
[15]王平.完善我国个人所得税费用扣除标准的研究[D].江西财经大学,财政学,2013,硕士.
[16]潘冲.金属纳米光波导的传播特性研究[D].北京邮电大学,光学,2013,硕士.
[17]魏雅芬,方杰,赵学勇,李胜功.科尔沁沙地樟子松人工林不同年龄针叶生理生态性状[J].植物生态学报,2011,12:1271-1280.
[18]李峰.基于CSCW的图书馆信息服务系统研究与设计[D].中国科学院研究生院（西安光学精密机械研究所）,2002.
[19]张吉,宋斌,唐成虹.保护测控装置嵌入式采样新平台的研制[J].电力系统自动化,2011,02:89-92.
[20]刘荣.依赖个体尺度分布的生物种群模型的行为分析及最优控制[D].杭州电子科技大学,运筹学与控制论,2013,硕士.
[21]张万书.有线电视技术现状与发展(2)[J].中国新闻科技.2000(02)
[22]祝闻.类金刚石薄膜的环境摩擦学特性和电化学腐蚀性能研究[D].西南大学,材料学,2014,硕士.
[23]曹雅楠.《他们眼望上苍》的原型分析[D].浙江大学,英语语言文学,2013,硕士.
[24]侯琳.基于EDEM离散元方法的抛丸器工作过程分析[D].济南大学,机械设计及理论,2012,硕士.
[25]施亚振.基于网格的神经计算平台架构及接口设计与实现[D].浙江大学,计算机软件与理论,2004,硕士.
[26]闫俊宏.供应链金融融资模式及其信用风险管理研究[D].西北工业大学,2007.
[27]黄玉佩.汇率驱动型内生进步机制研究[D].吉林财经大学,国际商务（专业学位）,2014,硕士.
[28]厉飞芹.民营养老机构服务氛围、情感劳动与服务质量的关系研究[D].浙江工商大学,企业管理,2013,硕士.
[29]顾海迪.Tim-3分子在胃癌荷瘤个体NK细胞上的表达分析及临床意义[D].苏州大学,肿瘤学（专业学位）,2013,硕士.
[30]王蕾.初中化学教师在教学中应用PPT课件的现状研究[D].东北师范大学,科学与技术教育,2012,硕士.
[31]孙滨.硅藻土处理城市生活垃圾渗滤液的实验研究[D].东北大学,化工过程机械,2010,硕士.
[32]刘春慧.棉铃虫北疆田间种群钙粘蛋白基因突变的检测与鉴定[D].南京农业大学,农业昆虫与害虫防治,2011,硕士.
[33]项玮.湘西苗疆抗战动员研究（1936-1938）[D].中国政法大学,中国近现代史,2014,硕士.
[34]吴琳.科技人才资源共享对突破性技术创新的支撑作用研究[D].西安电子科技大学,技术经济及管理,2012,硕士.
[35]蒋振声,郑醒尘,陈曦.资本市场系统结构模型应用研究[J].控制与决策,2005,06:656-659.
[36]蒲忠,刘险峰.谈客户关系管理认识上的误区及应对措施[J].现代管理科学,2005,10:92-93+113.
[37]赵路明.集成电路精密引线模具微细超声加工设备开发及实验研究[D].北京交通大学,2015.
[38]施林燕.初级对外汉字教材研究[D].广西师范大学,语言学及应用语言学,2014,硕士.
[39]孙若雪.下肢动脉粥样硬化的超声检查及其危险因素分析[D].吉林大学,临床医学,2014,硕士.
[40]张齐昊.Δ∑小数分频频率综合器的系统建模及电路设计[D].华南理工大学,集成电路工程,2012,硕士.
[41]黄勇.湘潭移动通信分公司农村营销渠道优化研究[D].湖南大学,工商管理,2013,硕士.
[42]张祎.英国学院学校（Academy）办学体制研究[D].东北师范大学,比较教育学,2012,硕士.
[43]高扬.创新科技引领新材料发展潮流——记北京清大际光科技发展有限公司董事长孙清友[J].海峡科技与产业,2014,12:60-63.
[44]盛军.宁夏特色产业之清真牛羊肉出口问题及对策研究[D].宁夏大学,工商管理（专业学位）,2014,硕士.
[45]杜晓佳.网络虚拟财产的民法保护研究[D].辽宁大学,法律,2012,硕士.
[46]吴云亚.国债收益率曲线及其波动的实证研究[D].对外经济贸易大学,金融学,2004,硕士.
[47]简鑫.富康医药集团公司发展战略研究[D].兰州大学,工商管理（专业学位）,2013,硕士.
[48]卜祥海.延安时期马克思主义大众化研究[D].扬州大学,中共党史,2011,硕士.
[49]胡畔.石油装备制造业竞争力评价及提升路径研究[D].东北石油大学,石油工程管理,2013,硕士.
[50]易小凯.西方写实肖像油画中光的表达[D].云南师范大学,美术学,2013,硕士.